Проведение анализа дс ифа вич аг подтверждающий. Анализ на ВИЧ методом ИФА: точность, достоверность

ИФА (иммуноферментный анализ, ELISA – англ.) вошел в жизнь практической медицины еще где-то в 60-х прошлого столетия. Первоначальной его задачей были гистологические исследования в научных целях, которые сводились к поиску и идентификации антигенной структуры клеток живого организма.

В основе метода ИФА лежит взаимодействие специфических (АТ) и родственных антигенов (АГ) с образованием комплекса «антиген – антитело» , который выявляют при помощи фермента. Этот факт натолкнул ученых на мысль, что метод может быть использован в диагностических целях для выявления специфических иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе на ту или иную инфекцию. И это был прорыв в клинической лабораторной диагностике!

Активно использоваться метод начал только в начале 80-х и то, в основном, в специализированных учреждениях. Первыми иммуноферментными анализаторами были снабжены центры и станции переливания крови, инфекционные и венерологические стационары, поскольку рожденный на африканском континенте, появившийся на горизонте у нас и тут же примкнувший к «старым» инфекциям грозный СПИД, требовал незамедлительных мер диагностики и поиска лечебных препаратов, воздействующих на него.

Область применения метода ИФА

Возможности иммуноферментного анализа поистине обширны. Теперь и представить себе трудно, как можно обойтись без подобных исследований, применяемых буквально во всех отраслях медицины. Кажется, что может сделать ИФА в онкологии? Оказывается, может. И многое. Способность анализа находить маркеры, свойственные некоторым видам злокачественных новообразований, лежит в основе раннего выявления опухоли, когда другим способом она еще не определяется из-за своих небольших размеров.

Современная клиническая лабораторная диагностика (КДЛ), кроме онкомаркеров, располагает значительным арсеналом панелей для ИФА и использует их для диагностики различных патологических состояний (инфекционных процессов, гормональных нарушений) и мониторинга фармацевтических лечебных препаратов с целью выявления их влияния на организм больного и, кстати, не только человека. В настоящее время иммуноферментный анализ широко используется и в ветеринарной службе, ведь «братья наши меньшие» тоже подвержены многим заболеваниям, от которых, порой, очень сильно страдают.

Таким образом, ИФА, благодаря своей чувствительности и специфичности, по образцу крови, взятому из вены, может определить:

• Гормональный статус (гормоны щитовидной железы и надпочечников, половые гормоны);
• Присутствие вирусной и бактериальной инфекции (ВИЧ, В и С, хламидиоз, сифилис, и , и , а также многие другие болезни, вызванные патогенными микроорганизмами);
• Следы жизнедеятельности микроорганизмов, возбудивших инфекционный процесс, который благополучно закончился и перешел в стадию формирования иммунного ответа на этот возбудитель. Такие следы, то есть, антитела, во многих случаях остаются циркулировать в крови пожизненно, чем защищают человека от повторного заражения.

В чем суть ИФА?

Иммуноферментный метод, позволяет определить не только присутствие самого возбудителя (качественный анализ), но и его количественное содержание в сыворотке крови больного.

Вирусовая или бактериальная доза существенно влияет на течение инфекционного процесса и его исход, поэтому количественному анализу отведена не последняя роль в диагностике и лечении заболеваний в различных формах и стадиях.

Однако зная иммуноферментные исследования, как метод ИФА, мы даже не задумываемся, как же ему удается охватить такой широкий круг микроорганизмов, населяющих нашу планету, многие из которых несут прямую угрозу здоровью и жизни человека и животных. А дело в том, что ИФА имеет много вариантов (неконкурентный и конкурентный – прямой и непрямой), каждый из которых решает свою задачу и, таким образом, позволяет проводить целенаправленный поиск.

Для выявления иммуноглобулинов того или иного класса используется традиционная 96-луночная полистироловая панель (планшет), в лунках которой в твердой фазе сосредоточены сорбированные рекомбинантные белки. Попавшие в лунку с сывороткой крови антитела или антигены, находят «знакомый» объект и образуют с ним комплекс (АГ – АТ), который, закрепившись ферментным конъюгатом, при считывании результатов проявится изменением окраски лунки.

Иммуноферментный анализ проводится на тест-системах определенной специфичности, изготовленных в специальных лабораториях и укомплектованными всеми необходимыми реагирующими компонентами. Исследования можно проводить с помощью промывных аппаратов («вошеров») и считывающих спектрофотометров, где большей частью задействован ручной труд. На полных автоматах, освобождающих лаборанта от монотонного закапывания, промывания и прочих рутинных дел, конечно, работать быстрее и удобнее, но не все лаборатории могут позволить себе такую роскошь и продолжают работать по старинке – на полуавтоматах.

Интерпретация результатов ИФА находится в компетенции врача лабораторной диагностики, при этом обязательно берется в расчет и присущее практически всем иммунохимическим реакциям свойство давать ложноположительные или ложноотрицательные ответы.

Видео: современное проведение иммуноферментного анализа

Результаты ИФА на примере сифилиса

Иммуноферментный анализ подходит для выявления всех форм , а, кроме этого, применяется в проведении скрининговых исследований. Для проведения анализа используют венозную кровь пациента, взятую натощак. В работе используются планшеты с определенной специфичностью (АТ классов А, М, G) или суммарные антитела.

Учитывая то, что АТ при сифилисе продуцируются в конкретной последовательности, ИФА может легко ответить на вопрос, когда произошло заражение и в какой стадии находится процесс, а расшифровка полученных результатов может быть представлена в следующем виде:

• IgM указывают на продолжительность инфекционного процесса (могут появляться при обострении хронических воспалительных заболеваний);
• IgA констатируют, что заражение случилось более месяца назад;
• IgG свидетельствуют о том, что инфекция находится в самом разгаре или о проведенном недавно лечении, что легко выясняется при сборе анамнеза.

При проведении анализа на сифилис, лунки с отрицательным ответом (и отрицательный контроль) останутся бесцветными, в то время как положительный результат (как и положительный контроль) даст ярко-желтое окрашивание за счет изменения цвета хромогена, добавленного в ходе исследования. Однако интенсивность окраски не всегда совпадает с контролем, то есть, она может быть немного бледнее или слегка желтоватой. Это сомнительные результаты, которые, как правило, подлежат повторному исследованию с обязательным учетом количественных показателей, полученных на спектрофотометре, но в целом, окраска находится в прямо пропорциональной зависимости от количества иммунных комплексов (связанные между собой АГ и АТ).

Самый волнительный из иммуноферментных анализов – ИФА на ВИЧ

Анализ на , пожалуй, больше других интересен широкому кругу населения, ведь пока нельзя с уверенностью утверждать, что исчезли многие социальные проблемы (проституция, наркомания и др.). К сожалению, ВИЧ затрагивает не только эти слои человеческого общества, заразиться можно при различных обстоятельствах, не связанных с половой распущенностью или приемом наркотиков. Но коль возникла необходимость обследования на ВИЧ, то бояться не следует, что все вокруг узнают о посещении такой лаборатории. Сейчас ВИЧ-инфицированные люди защищены законом, а сомневающиеся могут обратиться в анонимные кабинеты, где можно решить проблему, не боясь огласки и осуждения.

Иммуноферментный метод, применяемый для диагностики ВИЧ инфекции, относится к первостепенным стандартным исследованиям, которые, однако, требуют особых условий, поскольку тема очень деликатная.

ИФА на ВИЧ имеет смысл проводить после полового контакта, переливания крови, других медицинских манипуляций , предполагающих заражение, и по окончании инкубационного периода («серонегативное окно»), но следует учитывать, что этот промежуток времени не является постоянным. Он может закончиться через 14-30 дней, а может продолжаться до полугода, поэтому средним значением принято считать интервал от 45 до 90 дней. На ВИЧ кровь сдают так же, как и на другие инфекции – из вены на голодный желудок. Результаты будут готовы в зависимости от накопления материала в лаборатории и ее загруженности (от 2 до 10 дней), хотя чаще всего лаборатории обеспечивают получение ответа в тот же день или на следующий.

Что можно ожидать от результатов на ВИЧ?

ИФА на ВИЧ-инфекцию определяет антитела к двум разновидностям вируса: ВИЧ-1 (более распространенный в России и других странах Европы и Азии) и ВИЧ-2 (встречающийся чаще на территории Западной Африки).

Задачей ИФА ВИЧ является поиск АТ класса G, которые выявляются на всех тест-системах, но в более позднем периоде, и АТ классов А и М, выявляемых на рекомбинантных тест-наборах нового поколения, позволяющих найти антитела на самых ранних стадиях (инкубационный период – «серонегативное окно»). От ИФА можно ожидать следующие варианты ответов:

Первичный положительный результат: кровь подлежит перепроверке на тест-системе такого же типа, но по возможности другой серии и другим человеком (лаборантом);

Повторный (+) предполагает новый забор крови у пациента с исследованием ее подобно первичному анализу;

Очередной положительный результат подлежит референтному анализу, при котором используются высокоспецифичные тест-наборы (2-3 шт.);

Положительный результат в обеих (или в трех) системах направляется на иммуноблотинг (тот же ИФА, но выполненный в индивидуальном порядке на тест наборах особо высокой специфичности).

Заключение о ВИЧ инфицировании выносится только на основании иммуноблотинга. Проводится беседа с инфицированным в условиях полной конфиденциальности. Разглашение медицинской тайны в России, как, впрочем, и в других странах, подлежит уголовному наказанию.

Анализы на хламидии и цитомегаловирус иммуноферментным методом также обрели особую популярность, ввиду того, что позволяют определить время заражения, стадию заболевания и эффективность лечебных мероприятий.

При внедрении тоже можно наблюдать появление антител различных классов в разных фазах патологического состояния, вызванного инфекционным агентом:

• IgM могут обнаружиться уже дней через семь после заражения;
• IgA говорят о том, что инфекция в организме живет уже более месяца;
• IgG подтверждают диагноз хламидиоза, помогает следить за лечением и определить его действенность. Следует заметить, что антитела класса G остаются и циркулируют в организме независимо от давности болезни, поэтому для правильной расшифровки анализа нужно принимать во внимание референтные значения (нормы), которые, кстати, для каждой КДЛ свои: с учетом марки тест-системы и специфичности реагентов, входящих в набор. Значения нормы вписываются в бланк рядом с результатом ИФА.

Что касается , то здесь несколько иначе: антитела класса М появляются приблизительно через месяц-полтора, то есть, положительным результат (IgM+) становится в фазе первичного инфицирования или при реактивации скрытой инфекции и остается таковым от 4 месяцев до полугода.

Наличие АТ класса G характерно для начала первичной острой инфекции или реинфекции. Анализ констатирует, что вирус имеет место, однако информации, в какой стадии находится инфекционный процесс – не дает. Между тем, определение нормы титра IgG тоже вызывает затруднения, так как она целиком зависит от иммунного статуса конкретного человека, который, впрочем, устанавливается выявлением иммуноглобулинов класса G. Учитывая такое поведение антител, при диагностике ЦМВИ возникает необходимость в оценке способностей антител класса G взаимодействовать с ЦМВ, чтобы потом «обезвредить» его (авидность АТ). На начальном этапе болезни IgG очень плохо связываются с антигенами вируса (низкая авидность) и лишь потом начинают проявлять активность, стало быть, можно говорить о повышении авидности антител.

О достоинствах иммуноферментного анализа можно говорить долго и много, ведь этот метод сумел решить многие диагностические задачи, используя лишь венозную кровь. Не нужно долгих ожиданий, волнений и проблем с забором материала для исследования. К тому же тест-системы для ИФА продолжают совершенствоваться и не за горами тот день, когда тест выдаст 100% достоверность результата.

Видео: учебный фильм МГМУ им. Сеченова об основах ИФА

Цена: по запросу

Вы можете добавить товар в корзину, указав количество

Производитель: Диагностические системы

Страна: Россия

Ед. изм.: набор

Вид упаковки: картонная коробка

Артикул: L-1823

Описание

Тест-система иммуноферментная для выявления антител классов G, M и А к Treponema pallidum (T. pallidum) в сыворотке (плазме) крови и ликворе человека с целью диагностики сифилиса, полный набор реагентов на 96х2 определения, подходит для ручных методик и постановки на автоматических анализаторах. В основе метода лежит принцип "ловушки", заключающийся в том, что специфические антитрепонемные антитела всех классов, присутствующие в образце, связываются одновременно с рекомбинантными антигенами - аналогами иммунодоминантных белков T.pallidum, зафиксированными в лунках планшета, и с теми же антигенами, меченными пероксидазой хрена, при совместной инкубации образцов сыворотки (плазмы) крови или ликворе человека и конъюгата. Изменение цвета субстратно-хромогенной смеси, содержащей ТМБ, при внесении ее в лунки планшета указывает на наличие в исследуемых образцах специфических антител к бледной трепонеме

Функциональное назначение

Выявление антител к Treponema pallidum играет важную роль при диагностике сифилиса, поскольку T.pallidum не может быть выделена из культуры клеток, а пробы для прямого определения возбудителя зачастую недоступны при латентных и поздних стадиях заболевания. В серодиагностике сифилиса используются используются нетрепонемные (РМП, RPR, VDRL) и трепонемные (РПГА, РИФ, ИФА) тесты. Иммуноферментные тесты для определения суммарных антител используются для массового скрининга донорской крови и для постановки диагноза сифилиса как составляющая часть комплекса серологических реакций. После успешно проведенной терапии реактивность трепонемных тестов в большинстве случаев сохраняется

Технические характеристики

Состав набора:
1. Планшет полистироловый 96-луночный разборный - 2 шт.,
2. Конъюгат - прозрачная желтая жидкость,
3. Контроль положительный - прозрачная красная жидкость,
4. Контроль отрицательный - прозрачная зеленая жидкость,
5. Промывочный раствор, концентрат, рН от 6,9 до 7,6,
6. ТМБ - прозрачная бесцветная жидкость,
7. Раствор субстрата - прозрачная бесцветная жидкость, pH ~4,2.
8. Стоп-реагент (0,2М),
9. Инструкция по применению и паспорт качества.
Условия хранения: при температуре +2...8°C, замораживание недопустимо.
Срок годности - 15 месяцев с даты производства, указанной на этикетке набора.
Соответствие требованиям ТУ 9398-182-05941003-2010.
Зарегистрировано в Росздравнадзор.

1 Назначение набора

1.1 Набор предназначен для одновременного выявления антител к вирусу иммунодефицита человека первого и второго типов (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) и антигена р24 ВИЧ-1 в сыворотке и плазме крови человека “in vitro” методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.

2 Характеристика и принцип работы набора

2.1 Состав набора:

Наименование компонента	Количество
Иммуносорбент	2 планшета
Положительный контрольный образец АТ (К + АТ)	1 флакон, 3 мл
Положительный контрольный образец АГ (К + АГ)	3 флакона, лиофилизованный препарат
Отрицательный контрольный образец (К –)	2 флакона по 3 мл
Раствор конъюгата №1 (РК-1)	1 флакон, 12 мл
Конъюгат №2 (Кг-2)	1 флакон, 1 мл
Раствор для разведения конъюгата №2 (РР-К2)	2 флакона по 18 мл
Буферный раствор для субстрата (БРС )	2 флакона по 18 мл
Хромоген ТМБ	1 флакон, 1 мл
Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т×25)	2 флакона по 50 мл
Стоп-реагент	1 флакон, 12 мл
Комплект ванночки для реагентов с наконечниками для многоканальных пипеток	1 комплект
Клейкая пленка

2.2 Основные компоненты набора " ИФА-HIV 1,2 AGAT " – иммуносорбент, раствор конъюгата №1 и конъюгат №2.

Иммуносорбент представляет собой полистироловый планшет, в лунках которого сорбирована смесь рекомбинантных антигенов ВИЧ-1 (gp41) и ВИЧ-2 (gp36) и моноклональных антител к антигену р24 ВИЧ-1.

Раствор конъюгата №1 представляет собой смесь меченых биотином моноклональных человеческих антител против антигена р24 ВИЧ-1 и меченых биотином рекомбинантных белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Конъюгат №2 представляет собой стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена.

Положительный контрольный образец АТ – сыворотка крови человека, содержащая антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, не содержащая антитела к вирусу гепатита С и Treponema pallidum, антиген р24 ВИЧ-1 и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Положительный контрольный образец АГ – сыворотка крови человека содержащая нативный антиген р24 ВИЧ-1, не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С и Treponema pallidum и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Отрицательный контрольный образец – сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВГС, антиген р24 ВИЧ-1 и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Принцип работы набора. При внесении в лунки планшета раствора конъюгата №1 и образцов сывороток инфицированной крови антиген р24 связывается как со специфическими антителами на твердой фазе, так и с моноклональными биотинилированными анти-р24 антителами, входящими в состав раствора конъюгата №1; ВИЧ-специфические антитела связываются как с рекомбинантными антигенами ВИЧ-1 и ВИЧ-2, сорбированными на твердой фазе, так и с антигенами, входящими в состав раствора конъюгата №1, образуя комплексы антиген-антитело. Иммунные комплексы анти-р24 специфических антител и антигена р24 выявляются конъюгатом №2. После отмывания несвязавшихся компонентов в лунки планшета добавляют раствор субстрата пероксидазы (перекись водорода) и хромогена ТМБ.

Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент (0,9 М раствор серной кислоты), и интенсивность окрашивания раствора в лунках измеряют на спектрофотометре как величину оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм.

Величина ОП прямо пропорциональна концентрации специфических антител и/или антигена р24 в образце сыворотки или плазмы. Чем выше содержание антител и/или антигена р24 в образце сыворотки, тем выше интенсивность окрашивания.

2.3 Набор рассчитан на проведение на проведение 24 постановок ИФА: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений , включая контрольные образцы.

3 Меры предосторожности при работе с набором

3.1 Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. Однако работа со всеми исследуемыми образцами сыворотки (плазмы) крови человека, которые следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любой другой возбудитель вирусной инфекции, с отработанными растворами и жидкостями, различным оборудованием, которое может быть загрязнено в процессе анализа, требует определенных мер безопасности при использовании набора:

Работу необходимо проводить в специально оборудованном помещении;

Работать необходимо с применением средств индивидуальной защиты и с соблюдением мер предосторожности в соответствии с требованиями , , и .

3.2 Стоп-реагент, содержащий серную кислоту, обладает раздражающим действием. При попадании на кожу и слизистые немедленно промыть большим количеством воды.

3.3 При работе с набором рабочие места должны быть обеспечены приточно-вытяжной вентиляцией.

3.4 Все лица, работающие в лаборатории с наборами, должны проходить обязательный медицинский осмотр в соответствии с требованиями .

3.5 Утилизация медицинских отходов и/или неиспользованных наборов с истекшим сроком годности должна производиться в соответствии с требованиями .

4 Правила работы с набором

4.1 Для исключения ложных результатов исследуемые образцы необходимо готовить и хранить в условиях, предотвращающих бактериальный пророст. Необходимо осветлять образцы сывороток, содержащие агрегированные компоненты сыворотки или осадок, при помощи центрифугирования в течение (5-10) мин при скорости вращения 3000 об/мин. Образцы сывороток можно хранить при температуре (2-8) °С не более 5 сут. Замороженные образцы (желательно до температуры не менее минус 20 °С) можно хранить не более 1 года. Необходимо избегать повторных циклов замораживания-оттаивания образцов.

Необходимо помнить, что образцы с гемолизом, гиперлипидемией, бактериальным проростом, а также длительно хранившиеся без замораживания не пригодны для анализа.

Надежность результатов зависит от выполнения следующих правил:

Не допускается использование набора после окончания срока годности, а также смешивание компонентов наборов разных серий;

Для приготовления каждого реагента должна использоваться отдельная емкость;

Всю используемую для приготовления реагентов посуду не обрабатывать дезрастворами и моющими средствами. В случае необходимости промыть водой питьевой проточной, а затем пять раз ополоснуть дистиллированной водой;

Для работы с хромогеном ТМБ и РХ необходимо использовать отдельные емкости для растворов, наконечники для пипеток, посуду.

Необходимо обратить внимание на тщательное перемешивание реагентов;

Время между заполнением и опорожнением лунок планшета растворами и реагентами должно быть не менее 30 с. Не допускается подсыхание лунок на всех этапах постановки ИФА;

При использовании промывателя следить за состоянием емкости для раствора для промывания планшета и соединительных шлангов: в них не должно быть признаков бактериального или грибкового роста;

Необходимо использовать пипетки автоматические со сменными наконечниками, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3 %);

Дозаторы и рабочие поверхности обрабатывать раствором с объемной долей спирта этилового 70 %. Не использовать хлорамин и другие хлорсодержащие вещества;

Для работы с исследуемыми и контрольными образцами рекомендуется использовать одноразовые наконечники для пипеток. Каждый образец сыворотки, а также реагенты набора необходимо отбирать отдельным наконечником.

При внесении в лунки РК-1 нельзя касаться наконечником пипетки поверхности планшета и раствора, находящегося в лунках.

Во время проведения анализа следует избегать попадания прямых солнечных лучей на рабочую поверхность.

4.2 При вскрытии и растворении лиофилизованных компонентов необходимо следить, чтобы на крышке и стенках флаконов не оставалось сухого вещества.

5 Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа

5.1 Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий проводить измерения оптической плотности растворов в лунках планшета при длине волны 450 нм;

Полу- или автоматическое устройство для промывания планшетов (вошер);

Суховоздушный термостат типа ТС-80 М2, поддерживающий температуру (37±1) °С, или аналогичный ему по характеристикам;

Пипетки одноканальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости от 0,01 до 5,0 мл;

Пипетки 8-ми канальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости до 0,5 мл;

Мерный цилиндр вместимостью 2000 мл;

Колба лабораторная вместимостью 2000 мл;

Флаконы стеклянные вместимостью 20 мл;

Ванночки для реагентов или чашки Петри (диаметр 100 мм);

Вата медицинская гигроскопическая;

Бумага фильтровальная;

Перчатки резиновые хирургические;

Раствор с объемной долей этилового спирта 70 %;

Раствор с массовой долей перекиси водорода 6 %;

Вода деионизированная или дистиллированная;

Контейнер для сбора твердых отходов;

Контейнер для слива жидких отходов.

6 Подготовка к проведению анализа

6.1 Набор реагентов перед проведением анализа извлечь из холодильника, открыть крышку коробки и выдержать компоненты набора при температуре (18-25) °С в течение 30 мин .

Все образцы сывороток (плазмы) и реагенты перед проведением анализа тщательно перемешать.

Расход реагентов набора для постановки анализа, который определяется количеством используемых стрипов, приведен в таблице А.1 Приложения А.

6.2 Приготовление раствора для промывания планшета

Внимание! Раствор для промывания планшета готовить за 15 мин до начала проведения анализа!

Если флакон с ФСБ-Т×25 содержит осадок, его необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) °С до полного растворения осадка. В мерный цилиндр вместимостью 2000 мл внести содержимое флакона с ФСБ-Т×25, затем добавить дистиллированной воды до метки 1250 мл и аккуратно перемешать раствор. Раствор можно хранить при температуре (2-8) °С в течение 72 ч.

В случае использования одного или несколько стрипов содержимое флакона с ФСБ-Т×25 интенсивно встряхнуть в течение (20-30) с, отобрать необходимый объем раствора (таблица А.1) в мерный стакан или цилиндр, добавить необходимое количество дистиллированной воды и перемешать раствор. Неиспользованный ФСБ-Т×25 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.3 Подготовка иммуносорбента

Иммуносорбент готов к использованию.

Открыть пакет и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре (2-8) °С в течение 3 месяцев.

6.4 Подготовка К + АТ, К – , РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагента

К + АТ, К – , РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагент готовы к использованию.

Внимание! Во флаконе с РК-1 возможно выпадение осадка. Для проведения анализа необходимо использовать надосадочную жидкость.

Неиспользованные РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагент после вскрытия флаконов можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

Остаток К + АТ и К - после вскрытия флакона можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.5 Приготовление раствора К + АГ

Внимание! Раствор К + АГ готовить за 15 мин до начала проведения анализа!

Для восстановления лиофилизированного К + АГ перед вскрытием флакона легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флакона или пробки. Открыть флакон и положить пробку перевернутой на сухую поверхность. Внести во флакон 0,8 мл дистиллированной воды. Флакон закрыть пробкой, выдержать в течение 10 мин при температуре (18-25) °С и аккуратно наклоняя и вращая флакон, перемешать его содержимое до полного растворения, избегая образования пены.

Восстановленный К + АГ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение одного месяца, при температуре минус 20 °С – в течение шести месяцев. Допускается однократное замораживание-оттаивание восстановленного К + АГ.

6.6 Приготовление раствора Кг-2 в рабочем разведении

Из флакона с Кг-2 отобрать указанный в таблице А.1 объем и перенести во флакон с РР-К2. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество РР-К2, добавить Кг-2 в соответствии с таблицей А.1 и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Раствор Кг-2 в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием! Раствор Кг-2 в рабочем разведении можно хранить в течение 15 мин при температуре (18-25) °С. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток Кг-2 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.7 Приготовление рабочего раствора субстрата

Флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) ° С до полного растворения кристаллов .

Из флакона с хромогеном ТМБ отобрать указанный в таблице А.1 объем и перенести во флакон с БРС. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество БРС, добавить хромогена ТМБ в соответствии с таблицей А.1 и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием в защищенном от света месте! Раствор можно хранить в течение 20 мин при температуре (18-25) °С в защищенном от света месте.

Раствор необходимо предохранять от попадания света и контакта с металлами или ионами металлов. Перед использованием раствор субстрата должен быть бесцветным. Посуду, которая будет в ходе реакции контактировать с раствором субстрата, отмывать без применения синтетических моющих средств. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток хромогена ТМБ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

7 Требования к промыванию планшета

На всех этапах промывания необходимо контролировать заполнение всех лунок и полное удаление (аспирацию) жидкости из них;

Необходимо при каждом промывании все лунки заполнить раствором до краев (0,30-0,35 мл в лунку), без переполнения и перетекания жидкости из соседних лунок;

Необходимо выдерживать лунки, заполненными раствором для промывания планшета, в течение 30 с;

При каждой аспирации тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамкой со стрипами в перевернутом положении по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена;

Некачественное промывание планшета приводит к получению некорректных результатов.

8 Проведение анализа

8.1 В любые две лунки планшета внести по 0,07 мл (70 мкл) К + АТ , в две другие лунки– по 0,07 мл (70 мкл) К + АГ , в три другие лунки – по 0,07 мл (70 мкл) К – .

Внимание! При постановке ИФА на одном стрипе допускается использовать для К – - две лунки, для К + АТ – одну лунку, для К + АГ – одну лунку.

В остальные лунки планшета внести по 0,07 мл (70 мкл) исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови человека.

Внимание! Каждый образец необходимо отбирать одноразовым наконечником!

8.2 Во все лунки планшета поверх контрольных образцов и исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови сразу внести по 0,05 мл (50 мкл) РК-1 . Содержимое лунок перемешать осторожным постукиванием по краям планшета.

8.3 (37 ± 1) ° С в течение 60 мин .

Внимание! За (1-2) мин до окончания инкубации приготовить раствор Кг-2 в рабочем разведении (п 6.6).

8.4 Удалить содержимое лунок с помощью промывателя, затем промыть лунки планшета раствором для промывания планшета (п 6.2) семь раз.

8.5 Внести во все лунки планшета по 0,15 мл (150 мкл) раствора Кг-2 в рабочем разведении (п 6.6).

8.6 Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37 ± 1) ° С в течение 10 мин .

8.7 Удалить содержимое лунок планшета с помощью промывателя, затем промыть лунки планшетов раствором для промывания планшета (п 6.2) семь раз.

8.8 Во все лунки планшета внести по 0,15 мл (150 мкл) рабочего раствора субстрата (п 6.7).

При приготовлении рабочего раствора субстрата (п.6.7) флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием в течение (3-5) мин при температуре (37 ± 1)° С до полного растворения кристаллов.

8.9 Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37 ± 1) ° С в защищенном от света месте в течение 15 мин .

Внимание! По окончании инкубации в лунках с образцами сывороток, содержащими антитела к ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2, и/или антиген р24 ВИЧ-1, произойдет изменение окраски раствора от бесцветной до голубой различной интенсивности в зависимости от концентрации антител и/или антигена в исследуемом образце сыворотки.

8.10 Остановить пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки по 0,05 мл (50 мкл) стоп-реагента .

Внимание! В лунках с образцами сывороток, содержащими антитела к ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2, и/или антиген р24 ВИЧ-1, произойдет изменение окраски раствора с голубой на желтую различной интенсивности.

8.11 Не позже чем через (1-2) мин после остановки реакции определить ОП в лунках в одноволновом режиме при длине волны 450 нм .

9 Обработка результатов анализа

9.2 Результаты учитывать только в том случае если:

Значение ОПср К - не превышает 0,2 ОЕ;

Каждое отдельное значение ОП К - не должно отклоняться от ОПср К - более чем на 30%. Если одно из трех значений ОП К - выходит за этот предел, его следует исключить из расчета ОПср К - . Если два из трех значений ОП К - выходят за этот предел, анализ следует повторить на реагентах нового набора;

Значение ОПср К + АТ более 1,0 ОЕ;

Значение ОПср К + АГ более 1,0 ОЕ.

9.3 При соблюдении выше перечисленных условий вычислить критическое значение (ОПкрит.), ОЕ, по формуле (1):

ОПкрит. = ОПср К - + 0,14 (1).

10 Аналитические и диагностические характеристики

Чувствительность набора реагентов ИФА-HIV 1,2 AGAT по выявлению антигена р24 ВИЧ-1 –

Специфичность набора реагентов ИФА-HIV 1,2 AGAT – 100 % Стандарт АТ(-)ВИЧ. Стандартная панель сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого и второго типов (ВИЧ-1,2) и антиген ВИЧ-1(р24).ОСО42-28-214-02П.Кат№INS-20. ЗАО «МБС».

11 Форма выпуска набора

11.1 Набор выпускается в пяти вариантах комплектации:

1 комплект 1Р – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА на разборном планшете: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы;

2 комплект 2М – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 2 постановок ИФА на монолитных планшетах: 1 постановка – 1 планшет. Всего – 192 определений, включая контрольные образцы;

3 комплект 2Р – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 24 постановок ИФА на 2 разборны х планшетах: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений , включая контрольные образцы;

4 комплект А2М – проведение анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 2 постановок ИФА на монолитных планшетах: 1 постановка – 1 планшет. Всего – 192 определений, включая контрольные образцы;

5 комплект А2Р – проведение анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 24 постановок ИФА на 2 разборных планшетах: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений, включая контрольные образцы.

12 Условия хранения и применения набора

12.1 Хранение набора должно производиться в чистом, защищенном от влаги и света помещении при температуре (2-8)° С в течение всего срока годности. Запрещается замораживать компоненты набора.

12.2 Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.

12.3 Срок годности набора – 12 месяцев .

Приложение А

Таблица А.1 – Расход реагентов набора для постановки ИФА

реагента, мл

Количество используемых стрипов, шт.

Приготовление раствора для промывания планшета

ФСБ-Т×25

Дистиллированная вода

Приготовление раствора Кг-2 в рабочем разведении

РР-К2

Приготовление рабочего раствора субстрата

Хромоген ТМБ

Библиография

	Санитарные правила	Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 16.12.1998 г. № 351 О пересмотре ведомственных нормативных актов, регламентирующих вопросы по проблеме ВИЧ/СПИД
	Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 25.11.2002 г. № 165 О проведении дезинфекции и стерилизации учреждениями здравоохранения
	Постановление Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 28.04.2010 г. № 47 Об утверждении Инструкции о порядке проведения обязательных медицинских осмотров работающих и признании утратившими силу некоторых постановлений Министерства здравоохранения Республики Беларусь

ВИЧ – бич нашего поколения. Какие существуют методы для диагностики ВИЧ, углубленная информация о ИФА-тесте на ВИЧ. Как сдавать, как трактовать результаты анализа.

Вирус иммунодефицита человека – одна из самых страшных инфекций для нашего поколения.

ВИЧ деструктивно влияет на нашу иммунную систему, и если вовремя не остановить прогресс заболевания, он может трансформироваться в синдром приобретенного иммунодефицита . ВИЧ распространяется через непосредственный контакт партнеров при сексуальном акте через мужские и женские половые органы. Еще одной причиной заражения может стать попадание вируса через кровь. Это происходит вследствие использования нестерильных инструментов, переливанием зараженной крови и даже через поколения: ребенку от инфицированной матери при кормление грудью.

До сих пор ученые по всему миру ломают голову над созданием лекарства нового поколения, способного излечить от СПИДа, однако, несмотря на большие темпы научного прогресса, вирус иммунодефицита человека продолжает распространяться по планете.

ИФА – метод диагностики ВИЧ

Учеными поколения 20-го века разработано несколько методов диагностики ВИЧ, важнейшим из которых считают иммуноферментный анализ. ИФА на ВИЧ стали проводить относительно недавно – в начале девяностых годов. С течением времени метод оттачивался, приобретал новые детали. Теперь достоверность метода ИФА одна из самых высоких – около 98%. Соответственно, такой метод проводится все чаще.

ИФА – первый анализ, с которым сталкивается пациент при обследовании на ВИЧ. Метод ИФА определяет наличие в крови антител. Если тест находит присутствие антител в крови, значит, и вирус присутствует. Однако, информацию по этому тесту необходимо подкреплять и другими анализами, такими как иммунный блоттинг (ИБ) и метод последнего поколения – полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Антитела – специальные белковые соединения, которые продуцируют плазматические клетки после как реакцию на попадание в организм инфекции (антитела начинают образовываться через 1-2 месяца с момента заражения).

Причины возникновения ВИЧ

Врач выпишет вам направление на анализ, если вы контактировали с человеком, зараженным ВИЧ либо существует опасность инфицирования. К группе опасности заражения ВИЧ относят поколения людей:

• проходящих в течение месяца курс инъекционного лечения;
• имеющих сексуальные отношения без специальных средств предохранения;
• переносчиков инфекций, передающихся во время сексуального контакта;
• пациентам после прохождения процедуры переливания крови либо укола обнаружения причины свертывания крови в восьмидесятые годы.

Если у вас есть сомнения относительно вашего ВИЧ-статуса и опасения, связанные с возможностью заражения, рекомендуется незамедлительно обратиться за помощью в любое медицинское учреждение нашей страны для проведения комплексного обследования на ВИЧ. Результат на анализы получают в течение месяца. Людям в группе риска по ВИЧ рекомендуется проходить обследование через каждые 4 месяца.

Как сдать анализ

Какой-то особенной подготовки к сдаче анализа крови на ВИЧ не требуется, однако лучше придерживаться простейших правил:

• лучше не кушать с вечера, а сдавать анализ натощак утром;
• не советуют загружать организм физической работой;
• употреблять здоровую пищу, воздержаться на некоторое время от сигарет и алкоголя;
• для исключения ложных показателей теста не стоит сдавать анализ после лечения серьезных заболеваний.